PCR反應(yīng)中的強(qiáng)大新技術(shù)：讓基因分析變得更快更便宜

本文作者：張利

2017-01-19 18:28

導(dǎo)語(yǔ)：在傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)中，科學(xué)家應(yīng)該何時(shí)由“高溫變性”切換成“低溫退火”步驟呢？他們很迷?！?

雷鋒網(wǎng)AIHealth欄目按：DNA在高溫時(shí)可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制，此即為PCR體外擴(kuò)增DNA的原理。

范德堡大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了一種PCR反應(yīng)中擴(kuò)增DNA鏈的新方法，據(jù)稱這種技術(shù)可以讓基因分析變得更快更便宜，研究人員稱之為適應(yīng)性PCR技術(shù)（adaptive PCR ），該技術(shù)的核心是通過(guò)左旋DNA調(diào)節(jié)和監(jiān)控PCR反應(yīng)過(guò)程。

左旋DNA

正常DNA是右旋雙螺旋結(jié)構(gòu)，上世紀(jì)70年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了左旋DNA，左旋DNA的基因序列是正常DNA的鏡像。

PCR反應(yīng)中的強(qiáng)大新技術(shù)：讓基因分析變得更快更便宜

如上圖所示：A/B構(gòu)象是右旋，Z構(gòu)象是左旋

雖然左旋DNA與正常DNA的基因完全相同，但是其大多處于分子狀態(tài)，所以可以用熒光標(biāo)記物對(duì)左旋DNA進(jìn)行標(biāo)記，在PCR樣本中加入少量有熒光標(biāo)記的左旋DNA，與正常DNA進(jìn)行相同的復(fù)制過(guò)程，就可以跟蹤反應(yīng)。

傳統(tǒng)PCR的反應(yīng)與科學(xué)家的“迷茫”

要理解適應(yīng)性PCR的反應(yīng)過(guò)程，首先我們來(lái)復(fù)習(xí)一下傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增過(guò)程。

PCR由三個(gè)不同溫度的反應(yīng)階段構(gòu)成：

高溫變性：模板DNA解離，成為單鏈。
低溫退火：模板與引物結(jié)合。
適溫延伸：合成新的DNA鏈。

PCR反應(yīng)中的強(qiáng)大新技術(shù)：讓基因分析變得更快更便宜

這三種階段的劃分是通過(guò)人為控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)改變反應(yīng)溫度，實(shí)現(xiàn)雙鏈DNA變成單鏈、引物退火、引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA三個(gè)關(guān)鍵步驟。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，最關(guān)鍵的就是控制樣本的溫度，但通常也是困難。

關(guān)鍵是科學(xué)家不知道他們應(yīng)該何時(shí)改變反應(yīng)溫度？他們很迷茫。

通行的做法是：人為估計(jì)反應(yīng)所需時(shí)間，而不是根據(jù)某一個(gè)特定反應(yīng)步驟的結(jié)束來(lái)確定的。

適應(yīng)性PCR的突破

在適應(yīng)性PCR過(guò)程中，被熒光標(biāo)記的左旋DNA分子與樣本DNA進(jìn)行相同的反應(yīng)過(guò)程，就可以根據(jù)左旋DNA分子熒光的變化確定反應(yīng)終點(diǎn)。

根據(jù)熒光的增強(qiáng)和減弱，研究人員就能知道某一特定的反應(yīng)步驟是否完成了，以指導(dǎo)他們切換反應(yīng)溫度以進(jìn)入下一個(gè)反應(yīng)過(guò)程。

適應(yīng)性PCR可以在分子水平監(jiān)控反應(yīng)，自動(dòng)控制DNA的擴(kuò)增。在這個(gè)過(guò)程中，在樣本中加入少量左旋DNA，左旋DNA（L-DNA）顯示為藍(lán)色，模板DNA（D-DNA）即正常DNA顯示為綠色，左旋DNA游離狀態(tài)的引物熒光顯示為紅色，而游離的DNA單鏈熒光顯示為黃色。

以下是不同反應(yīng)階段及其顯示顏色：

變性階段（denaturation stage）：加熱樣本，DNA解離成單鏈，左旋DNA上的紅色和黃色熒光亮起。
退火階段（annealing stage）：PCR反應(yīng)中，左旋DNA樣本與左旋DNA結(jié)合，紅色熒光熄滅。
延伸階段（elongation stage）：在DNA聚合酶的參與下，模板DNA合成新鏈，同時(shí)左旋DNA沒(méi)有新鏈合成，但通過(guò)反應(yīng)中紅色熒光亮起可以判斷，進(jìn)入了下一輪的變性階段。

下圖即是適應(yīng)性PCR的過(guò)程圖解：

PCR反應(yīng)中的強(qiáng)大新技術(shù)：讓基因分析變得更快更便宜