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| 本文作者： 任平 | 2023-12-04 11:11 |
人類能否參透微觀世界的奧秘？
如果把這個(gè)問題放在生命科學(xué)領(lǐng)域，直接指向就是遺傳信息的最終生成物——蛋白質(zhì)。
人類的體內(nèi)有10萬種以上的蛋白質(zhì)，它們都是由20種氨基酸排列組合產(chǎn)生的。數(shù)十到數(shù)百的氨基酸集合成為擁有各種立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在它們的“坑洼”處和特定的物質(zhì)相結(jié)合，而發(fā)揮其各種各樣固有的機(jī)能。
這也就是說，只要拿到了每一種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，就能得知它的功能。
那么更進(jìn)一步地，人類想要在通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)輔助設(shè)計(jì)、新藥分子設(shè)計(jì)，研制出可以帶來領(lǐng)域變革的原創(chuàng)新藥，就變的“十拿九穩(wěn)”。
這并非隨意而下的定論。以醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)公認(rèn)的“雙十定律”來看，創(chuàng)新藥從開始研發(fā)到上市最少需要10年，耗資最少10億美元。但即使?jié)M足時(shí)間和金錢的雙重成本，創(chuàng)新藥研發(fā)成功的概率依然只有不足10%。
“這是一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)時(shí)代?！崩迩迳茖W(xué)的底層邏輯，在基礎(chǔ)科學(xué)與臨床藥物之間搭起一座橋梁，是無數(shù)人的終生理想。
在蛋白質(zhì)這一命題上，曾有全球科技巨頭谷歌旗下的前沿人工智能企業(yè)DeepMind，將機(jī)器學(xué)習(xí)和系統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)的最先進(jìn)技術(shù)結(jié)合起來，建立強(qiáng)大的通用學(xué)習(xí)算法，最搶眼的一大成果便是在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)上的應(yīng)用。
2020年底，其人工智能系統(tǒng)“AlphaFold 2”一戰(zhàn)成名，將人工智能預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)達(dá)到了實(shí)驗(yàn)測(cè)定的精確度。直到今年10月底，DeepMind對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究仍在繼續(xù)，并對(duì)外劇透：AlphaFold 3即將推出，已用于藥物設(shè)計(jì)。
具體細(xì)節(jié)可點(diǎn)擊文章：「AlphaFold 3」要來了？DeepMind最新推出新一代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具，已用于藥物設(shè)計(jì)
除了工業(yè)界的這位常青選手外，不少學(xué)術(shù)派也置身其中。
不過，一個(gè)最新里程碑進(jìn)展已經(jīng)出現(xiàn)：人類可望實(shí)現(xiàn)對(duì)所有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行高精度預(yù)測(cè)，彌補(bǔ)了AlphaFold 2對(duì)那些在天然蛋白質(zhì)中難以找到同源序列的蛋白質(zhì)無法進(jìn)行高精度結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的不足。
這一成果來自深圳灣實(shí)驗(yàn)室周耀旗教授團(tuán)隊(duì)（湯金樂、張哲、詹劍、周耀旗），目前該論文成果已經(jīng)上線預(yù)印本網(wǎng)站bioRxiv 。
鏈接：https://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.11.22.568372v1
眾所周知，通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)確定“高分辨率蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)”，既昂貴又耗費(fèi)力。直到AlphaFold 2的出現(xiàn)，開啟了一個(gè)基于深度學(xué)習(xí)的計(jì)算預(yù)測(cè)時(shí)代。
但，這一方法也僅適用于那些天然存在的、已有足夠同源序列的蛋白質(zhì)。
這是因?yàn)锳lphaFold 2主要依賴于進(jìn)化信息進(jìn)行預(yù)測(cè)。它是通過端到端的深度學(xué)習(xí)、利用大數(shù)據(jù)和大模型，找到了多個(gè)同源序列與相應(yīng)的“單一”結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。
也就是說，AlphaFold2強(qiáng)烈依賴于多序列比對(duì)(MSA)中的進(jìn)化和協(xié)同進(jìn)化信息。對(duì)于找不到太多同源序列的蛋白質(zhì)(例如抗體，孤兒蛋白，病毒蛋白，復(fù)合物等)，AlphaFold 2預(yù)測(cè)的精確度就會(huì)大幅度下降。
數(shù)據(jù)顯示，雖然估計(jì)AlphaFold 2可以覆蓋大約98.5%的人類蛋白質(zhì)組，但只有58%的殘基可以被可靠地預(yù)測(cè)，而只有36%的殘基可以被高置信度地預(yù)測(cè)。
拿抗體來說。抗體本身是針對(duì)新的抗原進(jìn)行的快速突變，進(jìn)化時(shí)間相對(duì)較短。它們是基于抗體庫(kù)中挑選出來的，因此抗體的序列并不多樣化，這導(dǎo)致過去AlphaFold 2難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)。
但這并非沒有解法。
解決同源序列不足的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的兩種方法是：
用新解析的基因組或宏基因組數(shù)據(jù)更新序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并提高同源搜索的靈敏度。這可能對(duì)某些蛋白質(zhì)有效，但不能解決那些缺乏天然同源序列的蛋白質(zhì)的問題。
另外一種方法是，通過學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他進(jìn)化序列，使用隱含進(jìn)化信息的蛋白質(zhì)語言模型。
然而，這兩種方法均無法對(duì)不同的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)一致的、高精度的預(yù)測(cè)。
“如果天然同源序列不充分，是否可以采用人工生成的同源序列來改進(jìn)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)？”
周耀旗教授作了一個(gè)形象比喻：既然上述蛋白質(zhì)沒有那么多兄弟姐妹，能否人為地制造多個(gè)，再用AlphaFold 2來預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。
但這一方法的難度在于：
其一，與大多數(shù)經(jīng)過數(shù)十億年進(jìn)化的天然序列不同，人工生成的同源序列是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化的短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的，目前尚不清楚高度同源序列(>95%序列同一性)，是否可以直接用于AlphaFold 2或相關(guān)的預(yù)測(cè)工具。
其二，大多數(shù)深度突變掃描實(shí)驗(yàn)都是通過功能篩選進(jìn)行的。例如抗生素抗性蛋白、熒光蛋白和具有特異結(jié)合性能的蛋白。鑒于數(shù)千種蛋白質(zhì)功能，不可能針對(duì)不同的功能開發(fā)不同的篩選技術(shù)，更不用說并不是所有的蛋白質(zhì)功能都適合高通量研究。
因此，利用人工同源序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷，將需要一種技術(shù)，它是基于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性來篩選結(jié)構(gòu)上同源的序列。
原則上，這種技術(shù)可以適用于所有依賴穩(wěn)定結(jié)構(gòu)發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)，無論其功能類型如何?，F(xiàn)有的監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)定性的方法，主要依賴于蛋白酶誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解或蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。
然而，每種技術(shù)都有其局限性，如篩選能力或靶蛋白的大小限制。更重要的是，這些技術(shù)并不是為預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)或測(cè)試的。
針對(duì)上述問題，周耀旗教授介紹，“我們發(fā)現(xiàn)，采用人工生成的、基于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性篩選的、并通過高通量測(cè)序所獲得的同源序列，作為AlphaFold2的輸入，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的高精度預(yù)測(cè)?！?/p>
周耀旗教授
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
?僅一輪帶有少量突變的大規(guī)模篩選，就足以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的高精度預(yù)測(cè)。
?對(duì)于實(shí)驗(yàn)的5個(gè)蛋白質(zhì)中的4個(gè)，只進(jìn)行了一輪深度突變序列的篩選，就足以使預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確度達(dá)到小于2? RMSD。其中3個(gè)蛋白質(zhì)的表現(xiàn)甚至優(yōu)于使用天然同源序列的AlphaFold2。
?唯一一個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)RMSD大于2?（2.92?）的蛋白質(zhì)，有一個(gè)完全暴露在表面上的β發(fā)夾，在非結(jié)晶條件下可能是可以靈活變動(dòng)的構(gòu)象。
值得注意的是，該研究通過將簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（深度突變掃描加體內(nèi)或體外篩選）與高通量測(cè)序相結(jié)合，顯著降低蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的成本，并提高周轉(zhuǎn)效率。
也就是說，這種具有成本效益的技術(shù)可以在任何分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，而不需要昂貴的設(shè)備。相比用實(shí)驗(yàn)方法解析這些結(jié)構(gòu)，如X射線衍射或冷凍電鏡等，費(fèi)用要低至少一個(gè)量級(jí)，而且該方法實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，后續(xù)有望改寫蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究范式。
此外，這一技術(shù)可以進(jìn)一步擴(kuò)展到預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及具有翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
據(jù)悉，這一方法命名為“Sibs-Seq”，兄弟姐妹的測(cè)序。
目前該論文成果已經(jīng)上線預(yù)印本網(wǎng)站 bioRxiv，標(biāo)題為《Effective High-Accuracy Prediction of Protein Structures from Easily Obtainable Artificial Homologous Sequences by Structure-Stability-Based Selection》（基于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的篩選，從容易獲得的人工同源序列中高效高精度地預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)）。
回到新藥研制的社會(huì)話題上，該方法也將有極大的應(yīng)用價(jià)值。
通過預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和變化，可以更好地了解蛋白質(zhì)與藥物相互作用的機(jī)制、抗體與抗原相互作用機(jī)制，從而設(shè)計(jì)出更有效的藥物。
此外，該方法還可以應(yīng)用于合成生物學(xué)領(lǐng)域。通過預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和變化，可以更好地了解合成生物學(xué)中的生物系統(tǒng)如何響應(yīng)外部刺激，從而優(yōu)化生物系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和性能。
“在我們的工作過程中有一大驚喜，反而成為了這一研究的重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)?！?/p>
周教授意思是指，利用AlphaFold 2進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)時(shí)，如何處理自然進(jìn)化和人為變異的差異方面，已經(jīng)有了一些新發(fā)現(xiàn)。
由于自然進(jìn)化需要幾千萬年甚至幾億年的時(shí)間，這個(gè)過程中許多氨基酸發(fā)生了變化，且氨基酸變化的范圍廣泛且變化量大。因此，許多人在處理進(jìn)化信息時(shí)會(huì)排除相似同源的信息，認(rèn)為這些信息量太少?zèng)]有用處。
周耀旗團(tuán)隊(duì)雖然認(rèn)為人工低突變同源序列很有用，可以從中萃取出比較準(zhǔn)確氨基酸接觸圖，并在RNA上證明了這一點(diǎn)，但AlphaFold 2是用高突變的同源序列來訓(xùn)練的，可能需要人工進(jìn)行多輪進(jìn)化的多突變序列，才能到達(dá)一定的效果。他們沒想到，即使只改變一個(gè)或兩個(gè)氨基酸，只要有足夠的數(shù)量就可以使用AlphaFold 2來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，達(dá)原子精度。
他們這次實(shí)驗(yàn)一共做了的5個(gè)蛋白質(zhì)，里面有3個(gè)，利用獲得的人工同源序列，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比用天然同源序列還要精確，這是一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)。這表明，盡管天然同源序列對(duì)許多蛋白質(zhì)可以通過搜索獲取，但人工同源序列有它的優(yōu)勢(shì)。
周教授認(rèn)為：
首先，突變少，意味著對(duì)結(jié)構(gòu)的影響小，完全相同結(jié)構(gòu)的可能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然同源序列，因此大量少突變的人工同源序列比少量多突變的天然同源序列應(yīng)該對(duì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)更有用。其次，不像天然同源序列，人工同源序列的數(shù)量是可控的，如果覆蓋率不夠高，可以再做幾輪實(shí)驗(yàn)來達(dá)到目標(biāo)。
其次，自然進(jìn)化的序列還受功能以及其它與折疊不完全相關(guān)的因素決定，也包含著測(cè)序、比對(duì)可能錯(cuò)誤等過程帶來的噪音，而人工同源序列則信噪比好很多。
最后，該方法不同于利用功能篩選的方案，比如抗性基因的功能，利用結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性來篩選，保證了方法的普適性以及突變序列與原來序列結(jié)構(gòu)的一致性。
據(jù)周耀旗介紹，這一方法包括深度突變、穩(wěn)定性篩選、高通量測(cè)序和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等四大關(guān)鍵步驟。
1，深度突變：對(duì)基因進(jìn)行深度突變。這意味著對(duì)基因的整個(gè)序列進(jìn)行隨機(jī)突變，以單突變和雙突變?yōu)橹?，涵蓋了所有的位置，突變種類至少10^?6次方以上。
2，穩(wěn)定性篩選：突變后的>10^?6的基因庫(kù)會(huì)被裝入一個(gè)設(shè)計(jì)成能夠進(jìn)行穩(wěn)定性篩選的質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)到大腸桿菌里，其中突變后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高的基因變體，它會(huì)把鼠源二氫葉酸還原酶兩個(gè)片段拉在一起，形成有功能的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致甲氧芐啶耐藥性，大腸桿菌能夠在甲氧芐啶存在的條件下生存，繁殖，和擴(kuò)增，導(dǎo)致穩(wěn)定性高的基因變體被富集。反之，對(duì)于那些突變后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的基因變體，大腸桿菌沒有甲氧芐啶耐藥性，從而這些變體會(huì)減少或者消失。
3，高通量測(cè)序：在經(jīng)過一段時(shí)間（如12-36小時(shí)）的培養(yǎng)后，穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)會(huì)生長(zhǎng)得更快，這樣其序列數(shù)目就會(huì)更多。通過高通量測(cè)序可以測(cè)量出很多序列，其中有些序列的數(shù)量特別多，有些則非常少，還有的序列已經(jīng)消失。
4，預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)：通過比較不同突變體的富集度，可以估算其穩(wěn)定性。然后把結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的蛋白變體作為同源序列放到AlphaFold 2進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。這個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的過程就是該方法的最后一步。
2021年3月，周耀旗結(jié)束了長(zhǎng)達(dá)36年國(guó)外留學(xué)及教學(xué)生涯，加入深圳灣實(shí)驗(yàn)室，擔(dān)任系統(tǒng)與物理生物學(xué)研究所副所長(zhǎng)。
現(xiàn)階段主要工作是蛋白質(zhì)和RNA結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)、功能蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)、以及開發(fā)和應(yīng)用蛋白質(zhì)和RNA新語言模型。
在RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)上，周耀旗團(tuán)隊(duì)成功地開發(fā)了目前最大的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)MARS，大大改進(jìn)了通過RNAcmap進(jìn)行優(yōu)質(zhì)同源序列的搜索，并由此發(fā)展了RNA同源序列比對(duì)語言模型RNA-MSM，可以更加準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的堿基對(duì)。
此外，團(tuán)隊(duì)也發(fā)展了一個(gè)基于接觸圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)模型SPIN-CGNN，比目前的方法在多個(gè)計(jì)算指標(biāo)上有不少的進(jìn)步。
而此次所有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的高精度預(yù)測(cè)工作，也是周耀旗這兩年來研究工作的一大里程碑。
“這是我回國(guó)后比較滿意的一個(gè)工作。”周耀旗表示。
同時(shí)他也指出，“在AlphaFold出現(xiàn)之前，靠測(cè)序來解析結(jié)構(gòu)這個(gè)念頭就有了。我2006年之后在美國(guó)印第安納大學(xué)開始做這個(gè)項(xiàng)目，在澳洲與詹劍、張哲、熊鵬等合作利用RNA證明了低突變的同源序列具有高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)信息，如今在湯金樂加入團(tuán)隊(duì)后總算證明了人工同源序列的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)?！?/p>
該文以湯金樂，張哲為共同一作，詹劍和周耀旗為共同通信作者發(fā)在預(yù)印本網(wǎng)站 bioRxiv。先發(fā)預(yù)印本，周教授期望能夠得到更多的同行們的建議和指正。
詹劍，于2004年、2010年獲得中科大學(xué)士和博士學(xué)位。2010-2013年在美國(guó)印第安納大學(xué)與普渡大學(xué)印第安納波里斯聯(lián)合分校作為博士后，2013-2021年在澳大利亞格里菲斯大學(xué)糖組學(xué)研究所做研究員，現(xiàn)在是深圳灣實(shí)驗(yàn)室研究員，最近作為創(chuàng)始人建立了礪博生物，從事靶向RNA的小分子藥開發(fā)。
湯金樂，于2016年獲得蘇州大學(xué)的博士，2016-2021年在北京大學(xué)深圳研究生院化學(xué)生物學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院做博士后和助理研究員，2021年起加入周耀旗課題組擔(dān)任助理研究員。
張哲，2013年本科畢業(yè)于中科大生物技術(shù)專業(yè)，2021年通過GU-CAS聯(lián)合培養(yǎng)博士項(xiàng)目，獲得澳大利亞格里菲斯大學(xué)哲學(xué)博士學(xué)位，后續(xù)跟隨周耀旗回國(guó)加入深圳灣實(shí)驗(yàn)室，今年6月起留任周耀旗課題組擔(dān)任助理研究員，主要研究方向?yàn)镽NA相關(guān)的結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)。
詹劍、湯金樂、張哲
值得注意的是，回國(guó)以來，周耀旗教授也開始做一些比較偏應(yīng)用和轉(zhuǎn)化方向的工作。
2022年9月，他聯(lián)手詹劍、方超，利用三人分別在計(jì)算、生物和化學(xué)領(lǐng)域的專長(zhǎng)，共同創(chuàng)立了礪博生物（Ribopeutic），從事靶向RNA的小分子藥物的開發(fā)。目前基于人工智能、干濕閉環(huán)的RNA靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，礪博生物已發(fā)現(xiàn)多個(gè)選擇性高、活性好，靶向 RNA 的小分子，在癌癥、罕見病和病毒性感染等領(lǐng)域布局。
據(jù)周耀旗介紹，他們正在進(jìn)行另一個(gè)與RNA相關(guān)的工作，并預(yù)計(jì)很快就可以投稿。
“在RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)上，我們希望能夠在RNA結(jié)構(gòu)數(shù)量少的情況下，建立可以泛化的、有較高精度的預(yù)測(cè)模型。為產(chǎn)業(yè)界，特別是我們礪博生物的靶向RNA的小分子藥物研發(fā)引入AI4S的前沿進(jìn)展，并提供一系列基于基礎(chǔ)科學(xué)研究的源頭創(chuàng)新?！?/p>
｜深圳灣實(shí)驗(yàn)室周耀旗課題組，博士后招聘中
周耀旗教授，于2021年3月起作為資深研究員全職加入了深圳灣實(shí)驗(yàn)室。
他于1984年獲中國(guó)科技大學(xué)學(xué)士學(xué)位，于1990年獲美國(guó)紐約州立石溪大學(xué)博士學(xué)位。
曾在北卡州立大學(xué)、哈佛大學(xué)進(jìn)行博士后研究，師從諾獎(jiǎng)得主Martin Karplus教授。相繼在紐約州立布法羅大學(xué)擔(dān)任助理教授、終身副教授，在印第安納大學(xué)任終身正教授，在澳大利亞格里菲斯大學(xué)任正教授。主要從事蛋白質(zhì)/RNA的序列、結(jié)構(gòu)與功能和表型關(guān)系方面的基礎(chǔ)研究，以及生物分子檢測(cè)、藥物開發(fā)方面的應(yīng)用研究。
周耀旗課題組主要圍繞著RNA和蛋白質(zhì)的序列、結(jié)構(gòu)及功能之間的關(guān)系，以及生物高分子的應(yīng)用開發(fā)等幾方面進(jìn)行科學(xué)研究。
課題組研究的特色是結(jié)構(gòu)生物信息計(jì)算和現(xiàn)代高通量、自動(dòng)進(jìn)化生物技術(shù)相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)序列、結(jié)構(gòu)及功能之間關(guān)系的深刻理解，從而達(dá)到生物高分子在多方面應(yīng)用的這個(gè)目標(biāo)，其中包括精準(zhǔn)醫(yī)療服務(wù)的針對(duì)性藥物設(shè)計(jì)和個(gè)性化生物標(biāo)志物的檢測(cè)。
課題組主頁：http://zhouyq-lab.szbl.ac.cn/
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本文作者吳彤，長(zhǎng)期關(guān)注醫(yī)療科技方向，歡迎添加微信互通有無：icedaguniang 雷峰網(wǎng)雷峰網(wǎng)(公眾號(hào)：雷峰網(wǎng))
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