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雷鋒網(wǎng)消息，近日，瑞士科研團(tuán)隊(duì)在已知新冠病毒基因序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)反向遺傳學(xué)手段在酵母菌中快速構(gòu)建出了活的新冠病毒。
據(jù)悉，該技術(shù)能高效合成新冠病毒，尤其在新爆發(fā)病毒尚未被成功分離出之前，可以幫助科學(xué)家盡快向衛(wèi)生部門(mén)和實(shí)驗(yàn)室提供傳染性病毒毒株，且該替代方案更為高效、安全。
其論文成果“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”于 2020 年 2 月 21 日發(fā)表于 BioRxiv，尚未經(jīng)同行審議。
公開(kāi)資料顯示，該項(xiàng)研究的科研團(tuán)隊(duì)大多來(lái)自瑞士伯爾尼大學(xué)的科學(xué)家，他們聯(lián)合德國(guó)、俄羅斯多所科研院校與相關(guān)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)共同完成了該科研成果。
研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，利用已知的病毒基因組序列，通過(guò)反向遺傳學(xué)手段快速構(gòu)建出了新冠病毒，可以成為向衛(wèi)生部門(mén)和實(shí)驗(yàn)室提供傳染性病毒毒株的替代方法，還可以對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行遺傳修飾和功能表征，從而爭(zhēng)取時(shí)間對(duì)疫情爆發(fā)做出快速反應(yīng)。
論文中提到，反向遺傳學(xué)被認(rèn)為是一種不可或缺的工具，它能夠改變了人類(lèi)對(duì)病毒發(fā)病機(jī)制和疫苗開(kāi)發(fā)的認(rèn)識(shí)。
像冠狀病毒基因組這一類(lèi)大型的 RNA 病毒基因組，由于基因組較大且不穩(wěn)定，很難在大腸桿菌宿主中被克隆和操作，因此需要一種快速而強(qiáng)大的反向遺傳學(xué)平臺(tái)進(jìn)行研究。
此次，瑞士研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一個(gè)基于酵母的合成基因組學(xué)平臺(tái)，用于多種 RNA 病毒的基因重建，包括冠狀病毒科、黃病毒科和副粘病毒科等。
【 圖片來(lái)源：biorxiv 所有者：biorxiv 】
研究人員利用病毒分離物、克隆病毒 DNA、臨床樣本或合成 DNA 生成病毒亞基因組片段，然后使用轉(zhuǎn)化偶聯(lián)重組技術(shù) (TAR）克隆技術(shù)將基因組維持為酵母人工染色體（YAC），從而在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)一步重組。而 T7-RNA 聚合酶則被用于產(chǎn)生病毒 RNA，進(jìn)而可以產(chǎn)生活病毒。
研究團(tuán)隊(duì)首先在其他 RNA 病毒（如鼠肝炎病毒 MHV）中檢驗(yàn)了這一平臺(tái)的準(zhǔn)確度，團(tuán)隊(duì)測(cè)試了鼠肝炎病毒 A59 株中含有綠色熒光蛋白（MHV GFP）的基因克隆能力，結(jié)果表明測(cè)試的克隆中正確組裝了 MHV 基因組的 YAC 占 90%，這表明病毒在酵母中的組裝效率很高。
也正是利用該平臺(tái)，研究人員在拿到合成 DNA 片段后一周內(nèi)，對(duì)新冠病毒進(jìn)行了工程改造和復(fù)活。
值得一提的是，這是一項(xiàng)根據(jù)已知病毒基因組進(jìn)行病毒重建的基礎(chǔ)研究工作，該成果與此前的謠言之一“新冠病毒是人工合成的” 無(wú)關(guān)，該研究中實(shí)驗(yàn)室中構(gòu)建的新冠病毒是在疫情爆發(fā)后，根據(jù)已經(jīng)公布的病毒基因組序列進(jìn)行的病毒重建研究。
【 圖片來(lái)源：biorxiv 所有者：biorxiv 】
具體來(lái)看，研究團(tuán)隊(duì)將病毒基因組分成 12 個(gè)片段，大小在 0.5kbp-3.4kbp。同時(shí)，為了便于血清學(xué)診斷和在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)追蹤，研究團(tuán)隊(duì)將合成新冠病毒設(shè)計(jì)成可以表達(dá) GFP（綠色熒光蛋白）。
因此，研究團(tuán)隊(duì)又將片段 11 分成 3 個(gè)包含 GFP 序列的子片段，GFP 序列被插入 ORF7a（開(kāi)放閱讀框，ORF）中從而在總計(jì)有 14 個(gè)片段。
研究團(tuán)隊(duì)讓試劑公司化學(xué)合成上述 14 個(gè) DNA 片段，1 月 14 日下訂單，2 月 4 日拿到其中的 12 個(gè)片段。片段 5 和 7 在大腸桿菌中的克隆出現(xiàn)一些問(wèn)題未能完成。
不過(guò)，研究團(tuán)隊(duì)恰好同時(shí)獲得了慕尼黑一位患者的新冠病毒樣本（SARS-CoV-2/München1.1/2020/929），他們決定利用 RT-PCR 擴(kuò)增獲得片段 5 和片段 7。
利用 TAR 克隆，研究人員獲得了所有 6 種新冠病毒構(gòu)建體正確組裝的分子克隆。
隨后，研究人員利用轉(zhuǎn)化偶聯(lián)重組技術(shù)（TAR），用酵母菌的同源重組系統(tǒng)依據(jù)末端重復(fù)的序列，將這些 DNA 序列拼到一起。
獲得完整的病毒序列后，研究人員用 T7 RNA 聚合酶將這一 DNA 序列轉(zhuǎn)錄為病毒 RNA，將該 RNA 用電穿孔技術(shù)導(dǎo)入到 VeroE6（猴腎細(xì)胞）中，使得細(xì)胞被感染，培養(yǎng)這些細(xì)胞的上清液（含釋放出的病毒顆粒）注入到別的培養(yǎng)基中，可以感染別的細(xì)胞。
基于此，瑞士研究團(tuán)隊(duì)宣布，他們能在獲取病毒的合成 DNA 片段后僅一周的時(shí)間內(nèi)，對(duì)最近流行的新冠病毒的化學(xué)合成克隆進(jìn)行工程改造和復(fù)活。并且，其病毒的重組有很高的效率和準(zhǔn)確度，通常情況下，超過(guò) 90% 的克隆是正確的。
值得注意的是，研究人員還指出，盡管此前在酵母中進(jìn)行同源重組已被用于很多分子病毒的克隆，但這一研究在對(duì)通過(guò)這種方法快速生成大型 RNA 病毒的全長(zhǎng) cDNA 的可行性進(jìn)行了全面評(píng)估，尤其是這種大型 RNA 病毒在大腸桿菌中無(wú)法被穩(wěn)定克隆。
值得注意的是，除新冠病毒外，研究團(tuán)隊(duì)還報(bào)道了利用該技術(shù)合成構(gòu)建 MHV（鼠肝炎病毒，一種冠狀病毒）和 MERS-Cov 等，而 HCov-229E 和 Zika 病毒的構(gòu)建仍在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中。
雷鋒網(wǎng)注：文章內(nèi)容源于 biorxiv，雷鋒網(wǎng)編譯。
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